灵芝对P388白血病细胞抑制作用的实验研究
【摘要】 目的 探讨灵芝对小鼠白血病细胞P388增殖的抑制作用及其机制。方法 将灵芝加入小鼠骨髓细胞培养体系，观察灵芝对粒系集落CFU-G和红系集落CFU-E生成的影响;用ELISA法与MTT法检测灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活性及其对P388白血病细胞增殖的抑制作用，用Tunel法分析共培养上清液对P388细胞的促凋亡作用。结果 一定浓度的灵芝可以促进集落刺激因子依赖的骨髓细胞CFU-G和CFU-E的生成;灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388细胞的抑制比单独用灵芝的抑制强;而且，前者可促进P388细胞的凋亡，后者则不能，这可能与共培养上清液中TNF-α活性升高有关。结论 在一定的剂量范围内，灵芝能抑制P388白血病细胞增殖并促进P388细胞凋亡，而且还能增强造血效果，在白血病治疗中可起到良好的辅助作用。
关键词 灵芝 P388细胞 小鼠腹腔巨噬细胞 肿瘤坏死因子-α MTT法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)07-0961-03
, http://www.100md.com
An experimental study on the effects of Ganoderma
on mouse leukemic cell P388
Li Hongxuan，Cheng Wenying，Chen Honghong，et al.
Institute of Radiation Medicine of Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition and the mechanism of Ganoderma for mouse leukemic cell-P388cells.Methods In order to observe effects of Ganoderma on generation of CFU-G and CFU-E，certain mouse marrow cells had been cultivated with hot water extract of Ganoderma.TNF-αactivity was determined by ELISA method in the conditioned medium of hot water extract of Ganoderma activated macrophages.The inhibition of the medium on P388proliferation was detected by MTT method.The promotability of the medium on P388apoptosis was detected by TUNEL method.Results In some range of concentration，Ganoderma could promote the generation of marrow cells CFU-G and CFU-E which was relied on colony stimulating factor(CSF).The inhibition of the medium on P388proliferation was stronger than that of the hot water extract of Ganoderma.The medium could promote P388apoptosis，but the hot water extract of Ganoderma could not，which perhaps had something with the increasing of TNF-αactivity in the medium.Conclusion In a certain range，Ganoderma could not only inhibit proliferation of leukemic cells and promote its apoptosis，but promote hemopoietia.So it probably becomes a assistant drug in leukemic therapy.
, 百拇医药
Key words Ganoderma P388cell mouse ventro-macrophages TNF-α MTT method
白血病病人在化疗过程中，骨髓抑制的副作用是限制化疗药物使用剂量和应用时间的主要原因，如能找到既可抑制白血病细胞增殖，又能增强集落刺激因子促骨髓正常造血的药物，将对白血病治疗提供更多的帮助。有研究表明，灵芝在提高正常机体的免疫防御和免疫监视功能的同时，还能使荷瘤小鼠血清中一些免疫因子的水平改变，从而使肿瘤的生长受到抑制 [1] 。本文探讨了灵芝对骨髓造血的促进作用;并以小鼠P388白血病细胞为靶细胞，研究了灵芝对白血病细胞增殖的抑制作用，为灵芝在白血病治疗中成为有效的辅助药物提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料 动物:DBA小鼠，雌雄各半，6周龄(中科院 实验动物中心提供);细胞株:小鼠P388白血病细胞(中科院细胞
, 百拇医药
库提供)。试剂:灵芝提取物由日本和汉生药研究所提供，为深棕色粉末，取一定量溶于生理盐水中，置于80℃水浴中振荡2h，1500r/min离心10min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，保存于4℃，备用。脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品;TNF-α检测试剂盒购于上海晶美生物工程有限公司;Tunel试剂盒为Sigma公司产品;MTT为美国Sigma公司产品;重组G-CSF由日本KIRIN公司生产;重组EPO购自美国AMGEN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 按常规法制备小鼠骨髓单细胞悬液，配成CFU-G和CFU-E培养体系，CFU-G体系中含rhG-CSF0.25μg/ml，CFU-E体系中含rhEPO1IU/ml，实验组加不同浓度的灵芝提取物，并按灵芝的浓度分成3组，对照组用无灵芝培养液代替，每组平行3皿，置37℃，5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养后，倒置显微镜下计集落数。
, 百拇医药
1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞与灵芝共培养上清液的制备 常规取小鼠腹腔巨噬细胞，置于24孔板，3～4h后，温Hanks液冲洗3遍，洗去悬浮细胞，加入不同浓度的灵芝和终浓度为5μg/ml的LPS各500μl，对照组用等体积的RPMI-1640代替，培养2天后，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃储存备用。
1.2.3 MTT法检测灵芝对P388白血病细胞增殖的影响 采用指数生长期的P388细胞，调节细胞浓度为2×10 5 ，接种于96孔板，每孔50μl，分别加入不同浓度的灵芝50μl，以RPMI-1640为对照。另取一96孔板，接种与上述板相同浓度和数量的P388细胞，并加入不同浓度的灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清50μl，以不加灵芝的腹腔巨噬细胞培养上清作为对照。将上述两块96孔板于37℃、5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养48h后，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，继续培养4h，每孔中加入酸化异丙醇100μl，充分振荡后过夜，测每孔595nm的光密度值。细胞增殖抑制率=对照组OD值-用药组OD值/对照组OD值 ×100%。
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1.2.4 凋亡检测 指数生长期的P388细胞，调节细胞浓度为2×10 6 ，接种于24孔板，每孔500μl，然后加入不同浓度的灵芝500μl，以无灵芝培养液为对照，此为A板。另取一24孔板，接种与A板相同浓度和数量的P388细胞，再加入不同浓度的灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清液500μl，以不加灵芝的腹腔巨噬细胞培养上清液作为对照，此为B板。将A、B板37℃、5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养72h。每孔细胞按照Tunel试剂盒中的操作步骤检测凋亡率。
1.2.5 肿瘤坏死因子TNF-α活性检测 在预先以脂多糖(LPS)刺激的灵芝与巨噬细胞共培养上清液中 [8] ，先用TNF-α标准品建立TNF-α检测标准曲线;后用小鼠TNF-α试剂盒检测灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清液中的TNF-α活性。
2 结果
2.1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 采用集落法研究灵芝对造血的影响，对照组培养液中含集落刺激因子但无灵芝，实验组有与对照组相同剂量的集落刺激因子和不同浓度的灵芝。结果如表1所示，无论粒系集落CFU-G还是红系集落CFU-E的数量，实验组与对照组差异都有显著性，表明在一定的剂量范围内，灵芝可以促进集落刺激因子依赖的骨髓细胞集落形成，对造血有一定的促进作用。
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表1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 (略)
2.2 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388细胞增殖的影响 表2显示，20μg/ml灵芝和小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞增殖的抑制率达25%，而20μg/ml 灵芝单独应用对P388细胞作用的抑制率仅为3.5%;灵芝与巨噬细胞共培养上清液在100μg/ml、500μg/ml用药组的抑制率也比单用相同剂量灵芝的抑制率高，实验表明，灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞的增殖有抑制作用，而且比单独应用灵芝抑制效果更强。
表2 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞增殖的作用(略)
2.3 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对诱导P388细胞凋亡率的影响 如表3所示，单独应用灵芝各剂量组，与无灵芝的对照组的凋亡率差异均无显著性。但灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液与P388细胞共同培养48h后，不用灵芝的对照组其凋亡率为6%，而100μg/ml和1000μg/ml共培养上清液组的凋亡率分别为22%和16%，与对照组差异有显著性。实验表明，单独应用灵芝不能诱导P388白血病细胞凋亡，而灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞有促进凋亡的作用。
, 百拇医药
表3 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388细胞凋亡率的影响(略)
2.4 灵芝与巨噬细胞共培养上清液中TNF-α活性检测 用小鼠TNF-αELISA试剂盒检测，通过酶标仪测得的OD 450 值见表4。结果显示，一定剂量范围的灵芝可以促进小鼠巨噬细胞产生TNF-α，其中以10μg/ml与100μg/ml实验组尤为突出，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。
表4 灵芝与小鼠巨噬细胞共培养上清中TNF-α活性检测(略)
3 讨论
目前，白血病的治疗主要依赖化疗药物，而大多数的化疗药物具有骨髓抑制的副作用，使病人在化疗后出现明显的骨髓造血功能抑制，无法在合适的时间继续给予足量的化疗，导致治疗的失败。目前治疗化疗引起的骨髓抑制主要依靠重组的造血集落刺激因子，但集落刺激因子本身不能抑制白血病细胞的增殖，甚至还有零星的促进肿瘤细胞生长的报道 [2，3] ，只能作为短期支持治疗使用，加上其昂贵的价格也使许多病人难以承受。因此，寻找同时具有抑制肿瘤细胞增殖和促进造血功能恢复的药物，已成为白血病治疗的一个重要课题。贾永锋等 [4] 研究中，灵芝可以促进正常和骨髓抑制小鼠的骨髓细胞增生，提高外周血白细胞数及血红蛋白含量。也有一些研究发现灵芝能抑制肿瘤生长 [5] 。在本实验中，证实了一定浓度的灵芝可以促进集落刺激因子依赖的骨髓细胞集落的生成，使CFU-G和CFU-E的集落数增高，表明灵芝可以促进骨髓造血;同时，灵芝具有抑制P388白血病细胞生长的作用。对灵芝抑制白血病细胞生长的作用及机制，是值得进一步研究的。
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已经了解，灵芝的有效成分如灵芝多糖和灵芝酸都具有毒杀肿瘤细胞的作用，这在我们的研究中得到证实，实验表明，灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养上清液对P388细胞的抑制作用要比单独用灵芝强。另外，在单用灵芝的剂量组中，未见灵芝有诱导P388细胞凋亡的作用;但在灵芝和小鼠巨噬细胞共培养上清液的剂量组，出现了P388细胞的凋亡率上升;这表明是灵芝和小鼠巨噬细胞共培养时产生了某些生物活性成分，才导致P388细胞抑制率和凋亡率 升高。为进一步探索其机制，我们检测了共培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)的活性，实验发现该上清液的TNF-α的活性有明显升高。已有文献报道，TNF-α在体外可以诱导不同来源的细胞株如白血病u937细胞株、CEM细胞株、上皮MCF-7细胞株及骨髓瘤S8226细胞凋亡 [6～8] 。此外，TNF-α在体内也是一种重要的免疫调节因子，它不仅对肿瘤细胞具有细胞的毒性和生长抑制作用，而且能够诱导IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ的产生，促进IL-2受体α链的表达，介导内毒素休克和炎症反应，同时还有MHC1抗原表达上调，而MHC与免疫识别、排斥反应及CTL细胞毒有密切的关系。所以，实验检测到灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液中的TNF-α活性升高，在一定程度上阐明了该上清液可促进P388细胞凋亡的部分机制。
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综上所述，在一定的剂量范围内，灵芝不但能抑制白血病细胞生长和促进白血病细胞凋亡，而且还具有刺激造血和增强免疫功能的作用，因此有可能成为在白血病治疗中起良好辅助作用的药物。
参考文献
1 张群豪，林志彬.灵芝多糖GL-B的抑瘤作用和机制研究.中国中西医结合杂志，1999，544-547.
2 Iateaq Ahmed Shameem，Hiroaki Kurism，Hidiyasu Matsuyama E，et al.Direct and indirect effects of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor on in vitro colony formation of human bladder cancer cells.Cancer Immunol Immunother，1994，38:353-357.
, 百拇医药
3 Kotaro Segawa，Yoshio ueno，Tateshi Kataoka.In vivo tumor growth enˉhancement by granulocyte colony-stimulating factor.Jpn.J.Cancer Res，1991，92，440-447.
4 贾永锋.灵芝对小鼠造血系统的影响.灵芝的研究(—):上海:上海医科大学出版社，1993，52-56.
5 陈雪华，朱正纲.灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠抗肿瘤的实验性研究.上海免疫学杂志，2000，20(2):101-103.
6 Malorni W，Rainaldi G，Tritarelli E，et al.Tumor necrosis factorαis a powerful apoptotic induce in lymphoid leukemic cells expressing the p-170glycoprotein.Int J Cancer，1996，67:238-247.
, 百拇医药
7 Rawadi G，Roman-Roman S，Castego M，et al.Effect of mycoplasma ferrmentanson the myelomonocytic lineage.J Immunol，1996，156:670-678.
8 Zou，-W，Bar-Shavit，-Z.Dual modulation of osteoclast differentiaˉtion by
lipopolysaccharide.J-Bone-Miner-Res，2002，17(7):1211-1218.
作者单位:1 200032复旦大学放射医学研究所
2 美国纽约中西医结合诊疗中心
3 日本和汉生药研究所
(编辑 张璇), 百拇医药(李洪选)
关键词 灵芝 P388细胞 小鼠腹腔巨噬细胞 肿瘤坏死因子-α MTT法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)07-0961-03
, http://www.100md.com
An experimental study on the effects of Ganoderma
on mouse leukemic cell P388
Li Hongxuan，Cheng Wenying，Chen Honghong，et al.
Institute of Radiation Medicine of Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition and the mechanism of Ganoderma for mouse leukemic cell-P388cells.Methods In order to observe effects of Ganoderma on generation of CFU-G and CFU-E，certain mouse marrow cells had been cultivated with hot water extract of Ganoderma.TNF-αactivity was determined by ELISA method in the conditioned medium of hot water extract of Ganoderma activated macrophages.The inhibition of the medium on P388proliferation was detected by MTT method.The promotability of the medium on P388apoptosis was detected by TUNEL method.Results In some range of concentration，Ganoderma could promote the generation of marrow cells CFU-G and CFU-E which was relied on colony stimulating factor(CSF).The inhibition of the medium on P388proliferation was stronger than that of the hot water extract of Ganoderma.The medium could promote P388apoptosis，but the hot water extract of Ganoderma could not，which perhaps had something with the increasing of TNF-αactivity in the medium.Conclusion In a certain range，Ganoderma could not only inhibit proliferation of leukemic cells and promote its apoptosis，but promote hemopoietia.So it probably becomes a assistant drug in leukemic therapy.
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Key words Ganoderma P388cell mouse ventro-macrophages TNF-α MTT method
白血病病人在化疗过程中，骨髓抑制的副作用是限制化疗药物使用剂量和应用时间的主要原因，如能找到既可抑制白血病细胞增殖，又能增强集落刺激因子促骨髓正常造血的药物，将对白血病治疗提供更多的帮助。有研究表明，灵芝在提高正常机体的免疫防御和免疫监视功能的同时，还能使荷瘤小鼠血清中一些免疫因子的水平改变，从而使肿瘤的生长受到抑制 [1] 。本文探讨了灵芝对骨髓造血的促进作用;并以小鼠P388白血病细胞为靶细胞，研究了灵芝对白血病细胞增殖的抑制作用，为灵芝在白血病治疗中成为有效的辅助药物提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料 动物:DBA小鼠，雌雄各半，6周龄(中科院 实验动物中心提供);细胞株:小鼠P388白血病细胞(中科院细胞
, 百拇医药
库提供)。试剂:灵芝提取物由日本和汉生药研究所提供，为深棕色粉末，取一定量溶于生理盐水中，置于80℃水浴中振荡2h，1500r/min离心10min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，保存于4℃，备用。脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品;TNF-α检测试剂盒购于上海晶美生物工程有限公司;Tunel试剂盒为Sigma公司产品;MTT为美国Sigma公司产品;重组G-CSF由日本KIRIN公司生产;重组EPO购自美国AMGEN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 按常规法制备小鼠骨髓单细胞悬液，配成CFU-G和CFU-E培养体系，CFU-G体系中含rhG-CSF0.25μg/ml，CFU-E体系中含rhEPO1IU/ml，实验组加不同浓度的灵芝提取物，并按灵芝的浓度分成3组，对照组用无灵芝培养液代替，每组平行3皿，置37℃，5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养后，倒置显微镜下计集落数。
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1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞与灵芝共培养上清液的制备 常规取小鼠腹腔巨噬细胞，置于24孔板，3～4h后，温Hanks液冲洗3遍，洗去悬浮细胞，加入不同浓度的灵芝和终浓度为5μg/ml的LPS各500μl，对照组用等体积的RPMI-1640代替，培养2天后，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃储存备用。
1.2.3 MTT法检测灵芝对P388白血病细胞增殖的影响 采用指数生长期的P388细胞，调节细胞浓度为2×10 5 ，接种于96孔板，每孔50μl，分别加入不同浓度的灵芝50μl，以RPMI-1640为对照。另取一96孔板，接种与上述板相同浓度和数量的P388细胞，并加入不同浓度的灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清50μl，以不加灵芝的腹腔巨噬细胞培养上清作为对照。将上述两块96孔板于37℃、5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养48h后，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，继续培养4h，每孔中加入酸化异丙醇100μl，充分振荡后过夜，测每孔595nm的光密度值。细胞增殖抑制率=对照组OD值-用药组OD值/对照组OD值 ×100%。
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1.2.4 凋亡检测 指数生长期的P388细胞，调节细胞浓度为2×10 6 ，接种于24孔板，每孔500μl，然后加入不同浓度的灵芝500μl，以无灵芝培养液为对照，此为A板。另取一24孔板，接种与A板相同浓度和数量的P388细胞，再加入不同浓度的灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清液500μl，以不加灵芝的腹腔巨噬细胞培养上清液作为对照，此为B板。将A、B板37℃、5%CO 2 、饱和湿度培养箱培养72h。每孔细胞按照Tunel试剂盒中的操作步骤检测凋亡率。
1.2.5 肿瘤坏死因子TNF-α活性检测 在预先以脂多糖(LPS)刺激的灵芝与巨噬细胞共培养上清液中 [8] ，先用TNF-α标准品建立TNF-α检测标准曲线;后用小鼠TNF-α试剂盒检测灵芝与腹腔巨噬细胞共培养上清液中的TNF-α活性。
2 结果
2.1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 采用集落法研究灵芝对造血的影响，对照组培养液中含集落刺激因子但无灵芝，实验组有与对照组相同剂量的集落刺激因子和不同浓度的灵芝。结果如表1所示，无论粒系集落CFU-G还是红系集落CFU-E的数量，实验组与对照组差异都有显著性，表明在一定的剂量范围内，灵芝可以促进集落刺激因子依赖的骨髓细胞集落形成，对造血有一定的促进作用。
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表1 灵芝对CFU-G和CFU-E生成的影响 (略)
2.2 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388细胞增殖的影响 表2显示，20μg/ml灵芝和小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞增殖的抑制率达25%，而20μg/ml 灵芝单独应用对P388细胞作用的抑制率仅为3.5%;灵芝与巨噬细胞共培养上清液在100μg/ml、500μg/ml用药组的抑制率也比单用相同剂量灵芝的抑制率高，实验表明，灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞的增殖有抑制作用，而且比单独应用灵芝抑制效果更强。
表2 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞增殖的作用(略)
2.3 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对诱导P388细胞凋亡率的影响 如表3所示，单独应用灵芝各剂量组，与无灵芝的对照组的凋亡率差异均无显著性。但灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液与P388细胞共同培养48h后，不用灵芝的对照组其凋亡率为6%，而100μg/ml和1000μg/ml共培养上清液组的凋亡率分别为22%和16%，与对照组差异有显著性。实验表明，单独应用灵芝不能诱导P388白血病细胞凋亡，而灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液对P388白血病细胞有促进凋亡的作用。
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表3 灵芝与巨噬细胞共培养上清液对P388细胞凋亡率的影响(略)
2.4 灵芝与巨噬细胞共培养上清液中TNF-α活性检测 用小鼠TNF-αELISA试剂盒检测，通过酶标仪测得的OD 450 值见表4。结果显示，一定剂量范围的灵芝可以促进小鼠巨噬细胞产生TNF-α，其中以10μg/ml与100μg/ml实验组尤为突出，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。
表4 灵芝与小鼠巨噬细胞共培养上清中TNF-α活性检测(略)
3 讨论
目前，白血病的治疗主要依赖化疗药物，而大多数的化疗药物具有骨髓抑制的副作用，使病人在化疗后出现明显的骨髓造血功能抑制，无法在合适的时间继续给予足量的化疗，导致治疗的失败。目前治疗化疗引起的骨髓抑制主要依靠重组的造血集落刺激因子，但集落刺激因子本身不能抑制白血病细胞的增殖，甚至还有零星的促进肿瘤细胞生长的报道 [2，3] ，只能作为短期支持治疗使用，加上其昂贵的价格也使许多病人难以承受。因此，寻找同时具有抑制肿瘤细胞增殖和促进造血功能恢复的药物，已成为白血病治疗的一个重要课题。贾永锋等 [4] 研究中，灵芝可以促进正常和骨髓抑制小鼠的骨髓细胞增生，提高外周血白细胞数及血红蛋白含量。也有一些研究发现灵芝能抑制肿瘤生长 [5] 。在本实验中，证实了一定浓度的灵芝可以促进集落刺激因子依赖的骨髓细胞集落的生成，使CFU-G和CFU-E的集落数增高，表明灵芝可以促进骨髓造血;同时，灵芝具有抑制P388白血病细胞生长的作用。对灵芝抑制白血病细胞生长的作用及机制，是值得进一步研究的。
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已经了解，灵芝的有效成分如灵芝多糖和灵芝酸都具有毒杀肿瘤细胞的作用，这在我们的研究中得到证实，实验表明，灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养上清液对P388细胞的抑制作用要比单独用灵芝强。另外，在单用灵芝的剂量组中，未见灵芝有诱导P388细胞凋亡的作用;但在灵芝和小鼠巨噬细胞共培养上清液的剂量组，出现了P388细胞的凋亡率上升;这表明是灵芝和小鼠巨噬细胞共培养时产生了某些生物活性成分，才导致P388细胞抑制率和凋亡率 升高。为进一步探索其机制，我们检测了共培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)的活性，实验发现该上清液的TNF-α的活性有明显升高。已有文献报道，TNF-α在体外可以诱导不同来源的细胞株如白血病u937细胞株、CEM细胞株、上皮MCF-7细胞株及骨髓瘤S8226细胞凋亡 [6～8] 。此外，TNF-α在体内也是一种重要的免疫调节因子，它不仅对肿瘤细胞具有细胞的毒性和生长抑制作用，而且能够诱导IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ的产生，促进IL-2受体α链的表达，介导内毒素休克和炎症反应，同时还有MHC1抗原表达上调，而MHC与免疫识别、排斥反应及CTL细胞毒有密切的关系。所以，实验检测到灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液中的TNF-α活性升高，在一定程度上阐明了该上清液可促进P388细胞凋亡的部分机制。
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综上所述，在一定的剂量范围内，灵芝不但能抑制白血病细胞生长和促进白血病细胞凋亡，而且还具有刺激造血和增强免疫功能的作用，因此有可能成为在白血病治疗中起良好辅助作用的药物。
参考文献
1 张群豪，林志彬.灵芝多糖GL-B的抑瘤作用和机制研究.中国中西医结合杂志，1999，544-547.
2 Iateaq Ahmed Shameem，Hiroaki Kurism，Hidiyasu Matsuyama E，et al.Direct and indirect effects of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor on in vitro colony formation of human bladder cancer cells.Cancer Immunol Immunother，1994，38:353-357.
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3 Kotaro Segawa，Yoshio ueno，Tateshi Kataoka.In vivo tumor growth enˉhancement by granulocyte colony-stimulating factor.Jpn.J.Cancer Res，1991，92，440-447.
4 贾永锋.灵芝对小鼠造血系统的影响.灵芝的研究(—):上海:上海医科大学出版社，1993，52-56.
5 陈雪华，朱正纲.灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠抗肿瘤的实验性研究.上海免疫学杂志，2000，20(2):101-103.
6 Malorni W，Rainaldi G，Tritarelli E，et al.Tumor necrosis factorαis a powerful apoptotic induce in lymphoid leukemic cells expressing the p-170glycoprotein.Int J Cancer，1996，67:238-247.
, 百拇医药
7 Rawadi G，Roman-Roman S，Castego M，et al.Effect of mycoplasma ferrmentanson the myelomonocytic lineage.J Immunol，1996，156:670-678.
8 Zou，-W，Bar-Shavit，-Z.Dual modulation of osteoclast differentiaˉtion by
lipopolysaccharide.J-Bone-Miner-Res，2002，17(7):1211-1218.
作者单位:1 200032复旦大学放射医学研究所
2 美国纽约中西医结合诊疗中心
3 日本和汉生药研究所
(编辑 张璇), 百拇医药(李洪选)