菠萝叶提取物黏附漂浮微丸的制备及评价(1)
[摘要]采用挤出滚圆法，以壳聚糖为骨架黏附材料，十八醇为漂浮材料，制备菠萝叶提取物(Bolo leaf phenols，BLP)黏附漂浮微丸，评价其体外黏附性、漂浮性及体内滞留情况，并考察药物的体外释放特性。通过体外组织留存量法和直接观察法分别评价微丸的体外黏附性和漂浮性；采用体内组织留存量法和小动物活体成像法考察微丸在大鼠体内的滞留情况；对微丸中指标成分对香豆酸和咖啡酸的体外释放情况进行评价。结果显示，制备的黏附漂浮微丸体外黏附性达(732±34)%，在人工胃液中可立即起漂，持续漂浮时间在12 h以上；黏附漂浮微丸在大鼠胃内6 h时滞留率达40%以上，而普通参比微丸胃滞留率低于15%，两者相比，滞留效果具有显著性差异(P<001)；药物体外释放时间可达6 h以上，体外释药机制符合Higuchi方程。体内、外研究表明，制备的BLP黏附漂浮微丸具有良好的胃滞留效果和缓释特性。
[关键词]BLP黏附漂浮微丸； 组织留存量； 小动物活体成像； 体外释放； 缓释
, 百拇医药 菠萝叶提取物(Bolo leaf phenols，BLP)，含有30%～80%的总酚性成分，其中对香豆酸(pCA)和咖啡酸(CA)为主要指标成分[15]。BLP具有明确的抗氧化和调血脂作用[67]，其主要成分对香豆酸体内半衰期t1/2β为0587 h[8]，且对小鼠无明显生殖毒性[9]。基于BLP的药理活性，具有开发为临床药物的良好前景。
课题组前期对BLP的理化性质和吸收部位的研究表明，BLP在胃和小肠肠段的生理pH下稳定，在胃肠道吸收窗较长，且在酸性条件下脂溶性好，吸收较好[1011]。本研究应用胃滞留给药系统，采用挤出滚圆法制备壳聚糖黏附漂浮微丸，通过对微丸体外黏附性、漂浮性和体内滞留情况的考察，评价微丸的胃内滞留效果；通过微丸体外释药情况，考察微丸的体外释药机制。本研究旨在延长药物在胃部的滞留时间，促进药物的吸收，改善生物利用度。
1材料
11药物与试剂
, 百拇医药
BLP(清华大学杜立军教授实验室提供，批号110801)；BLP黏附漂浮微丸(自制，批号20160312)；对香豆酸对照品(pCA，美国Sigma公司，批号1001108036)；咖啡酸对照品(CA，美国Sigma公司，批号2063612)；壳聚糖(CTS，美国Sigma公司，CAS9012764)；微晶纤维PH101(MCC，日本旭日化成公司)；羟丙基甲基纤维素(HPMC K4M，美国卡乐康)；十八醇(北京化学试剂公司)；甲醇、乙腈(美国Fisher公司，色谱级)；DIR荧光染料(美国Invitrogen公司)；其余试剂、试药均为分析纯。
12仪器
岛津高效液相色谱仪(LC10AT泵，SPD10AVP紫外檢测器)；CTO10ASV柱温箱；小动物活体成像仪(美国IVIS Spectrum)；挤出滚圆机(英国Caleva公司)；盘式干燥烘箱(英国Caleva公司)；电热恒温水浴锅(HHSY11Ni2B，北京长风仪器仪表公司)；搅拌机(北京中兴柏翠电器有限公司)；Sartorius BSA 224SCW型天平。
, 百拇医药
13动物
SD大鼠，雄性，体重(220±20) g，北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SDXK (京) 20150001。
2方法与结果
21微丸的制备
按处方称取主药和辅料，过80目筛，加黏合剂不断捏合，制成软材。经挤出机筛板(孔径 07 mm) 以35 r·min-1的转速挤成直径相同、光滑致密的条状物； 将条状物置于滚圆机(孔径 07 mm) 内，以1 300 r·min-1的速度滚圆10 min，直至滚制成丸；取出微丸，50 ℃干燥4 h，过40目筛，制得所需微丸。
22体外黏附性考察
取新鲜离体大鼠胃，用01 mol·L-1盐酸将胃内壁冲洗干净，固定在玻璃片上，精密称取微丸约500 mg，均匀置于胃组织上。在相对湿度为925%的恒湿密闭容器中放置20 min充分水化后，将玻片倾斜45°放置，调节蠕动泵流速为20 mL·min-1，用01 mol·L-1盐酸100 mL冲洗。冲洗液收集于已知质量的烧杯中，70 ℃烘干，称重[1114]。微丸体外黏附百分率=M-(G-g-m)/M×100%。式中M为加入微丸的量；g为空烧杯重；G为烧杯与烘干后残渣总重；m为同体积冲洗液所含固体物质的量(空白对照)。实验结果得出，制备的黏附漂浮微丸体外黏附性达(732±34)%，体外生物黏附性良好。
, 百拇医药
23体外漂浮性考察
称取微丸约300 mg，置于100 mL，(370±05) ℃的01 mol·L-1 HCl溶液中，直接观察微丸的起漂和持续漂浮时间[1517]。结果表明，制备的黏附漂浮微丸，在人工胃液中可立即起漂，持漂时间在12 h以上，具有良好的体外漂浮性。
24体内滞留性考察
241体内组织留存量法取健康SD大鼠，禁食不禁水24 h，随机分2组，一组胃插管灌服黏附漂浮微丸，另一组灌服普通参比微丸，给药量400 mg·kg-1。于给药后1，2，4，6，8，10，12 h时间点处死大鼠，取出大鼠胃部，沿胃大弯方向从贲门到幽门处剪开直接观察胃内有无微丸滞留，并拍摄观察到的微丸胃内滞留现状，见图1。通过观察得出，制备的黏附漂浮微丸在6 h时仍有大量滞留于胃内，而普通参比微丸在4 h时已大量从胃内排空；表明制备的黏附漂浮微丸具有胃滞留的效果。
用01 mol·L-1盐酸100 mL冲洗并收集胃内滞留微丸，用烘箱70 ℃烘干，称重记录各时间点胃
254药物释放模型的拟合分别用零级，一级，Higuchi和RitgerPeppas方程对BLP黏附漂浮微丸中指标成分对香豆酸和咖啡酸的体外释药曲线进行拟合，见表1，2。结果显示，BLP黏附漂浮微丸中对香豆酸和咖啡酸的释放曲线经Higuchi方程拟合相关性最好，表明药物的释药机制以Fick′s骨架型扩散为主，即药物首先溶解通过壳聚糖骨架材料扩散到骨架外表面，再扩散到释放介质中，起到缓释的效果。, 百拇医药(何亚丽 黎迎 杨丹丹 朱春燕)
[关键词]BLP黏附漂浮微丸； 组织留存量； 小动物活体成像； 体外释放； 缓释
, 百拇医药 菠萝叶提取物(Bolo leaf phenols，BLP)，含有30%～80%的总酚性成分，其中对香豆酸(pCA)和咖啡酸(CA)为主要指标成分[15]。BLP具有明确的抗氧化和调血脂作用[67]，其主要成分对香豆酸体内半衰期t1/2β为0587 h[8]，且对小鼠无明显生殖毒性[9]。基于BLP的药理活性，具有开发为临床药物的良好前景。
课题组前期对BLP的理化性质和吸收部位的研究表明，BLP在胃和小肠肠段的生理pH下稳定，在胃肠道吸收窗较长，且在酸性条件下脂溶性好，吸收较好[1011]。本研究应用胃滞留给药系统，采用挤出滚圆法制备壳聚糖黏附漂浮微丸，通过对微丸体外黏附性、漂浮性和体内滞留情况的考察，评价微丸的胃内滞留效果；通过微丸体外释药情况，考察微丸的体外释药机制。本研究旨在延长药物在胃部的滞留时间，促进药物的吸收，改善生物利用度。
1材料
11药物与试剂
, 百拇医药
BLP(清华大学杜立军教授实验室提供，批号110801)；BLP黏附漂浮微丸(自制，批号20160312)；对香豆酸对照品(pCA，美国Sigma公司，批号1001108036)；咖啡酸对照品(CA，美国Sigma公司，批号2063612)；壳聚糖(CTS，美国Sigma公司，CAS9012764)；微晶纤维PH101(MCC，日本旭日化成公司)；羟丙基甲基纤维素(HPMC K4M，美国卡乐康)；十八醇(北京化学试剂公司)；甲醇、乙腈(美国Fisher公司，色谱级)；DIR荧光染料(美国Invitrogen公司)；其余试剂、试药均为分析纯。
12仪器
岛津高效液相色谱仪(LC10AT泵，SPD10AVP紫外檢测器)；CTO10ASV柱温箱；小动物活体成像仪(美国IVIS Spectrum)；挤出滚圆机(英国Caleva公司)；盘式干燥烘箱(英国Caleva公司)；电热恒温水浴锅(HHSY11Ni2B，北京长风仪器仪表公司)；搅拌机(北京中兴柏翠电器有限公司)；Sartorius BSA 224SCW型天平。
, 百拇医药
13动物
SD大鼠，雄性，体重(220±20) g，北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SDXK (京) 20150001。
2方法与结果
21微丸的制备
按处方称取主药和辅料，过80目筛，加黏合剂不断捏合，制成软材。经挤出机筛板(孔径 07 mm) 以35 r·min-1的转速挤成直径相同、光滑致密的条状物； 将条状物置于滚圆机(孔径 07 mm) 内，以1 300 r·min-1的速度滚圆10 min，直至滚制成丸；取出微丸，50 ℃干燥4 h，过40目筛，制得所需微丸。
22体外黏附性考察
取新鲜离体大鼠胃，用01 mol·L-1盐酸将胃内壁冲洗干净，固定在玻璃片上，精密称取微丸约500 mg，均匀置于胃组织上。在相对湿度为925%的恒湿密闭容器中放置20 min充分水化后，将玻片倾斜45°放置，调节蠕动泵流速为20 mL·min-1，用01 mol·L-1盐酸100 mL冲洗。冲洗液收集于已知质量的烧杯中，70 ℃烘干，称重[1114]。微丸体外黏附百分率=M-(G-g-m)/M×100%。式中M为加入微丸的量；g为空烧杯重；G为烧杯与烘干后残渣总重；m为同体积冲洗液所含固体物质的量(空白对照)。实验结果得出，制备的黏附漂浮微丸体外黏附性达(732±34)%，体外生物黏附性良好。
, 百拇医药
23体外漂浮性考察
称取微丸约300 mg，置于100 mL，(370±05) ℃的01 mol·L-1 HCl溶液中，直接观察微丸的起漂和持续漂浮时间[1517]。结果表明，制备的黏附漂浮微丸，在人工胃液中可立即起漂，持漂时间在12 h以上，具有良好的体外漂浮性。
24体内滞留性考察
241体内组织留存量法取健康SD大鼠，禁食不禁水24 h，随机分2组，一组胃插管灌服黏附漂浮微丸，另一组灌服普通参比微丸，给药量400 mg·kg-1。于给药后1，2，4，6，8，10，12 h时间点处死大鼠，取出大鼠胃部，沿胃大弯方向从贲门到幽门处剪开直接观察胃内有无微丸滞留，并拍摄观察到的微丸胃内滞留现状，见图1。通过观察得出，制备的黏附漂浮微丸在6 h时仍有大量滞留于胃内，而普通参比微丸在4 h时已大量从胃内排空；表明制备的黏附漂浮微丸具有胃滞留的效果。
用01 mol·L-1盐酸100 mL冲洗并收集胃内滞留微丸，用烘箱70 ℃烘干，称重记录各时间点胃
254药物释放模型的拟合分别用零级，一级，Higuchi和RitgerPeppas方程对BLP黏附漂浮微丸中指标成分对香豆酸和咖啡酸的体外释药曲线进行拟合，见表1，2。结果显示，BLP黏附漂浮微丸中对香豆酸和咖啡酸的释放曲线经Higuchi方程拟合相关性最好，表明药物的释药机制以Fick′s骨架型扩散为主，即药物首先溶解通过壳聚糖骨架材料扩散到骨架外表面，再扩散到释放介质中，起到缓释的效果。, 百拇医药(何亚丽 黎迎 杨丹丹 朱春燕)