芪参益气滴丸对肺心病大鼠心肌腺苷酸含量的影响(1)
[摘要]采用单次腹腔注射野百合碱(MCT)的方法复制大鼠肺心病模型，芪参益气滴丸浸膏灌胃给药6周后，通过HPLC检测大鼠右心肌组织中的腺苷酸(ATP，ADP，AMP)的含量，进而考察芪参益气滴丸对肺心病大鼠心肌能量代謝的影响。结果显示ATP，ADP，AMP达到良好分离；ATP，ADP，AMP在考察的浓度范围内，线性关系良好；加样回收率均在90%～108%；与模型组相比，高剂量给药组大鼠心肌中ATP的含量显著性升高，ADP的含量有升高趋势，AMP含量有下降趋势。提示芪参益气滴丸能够改善心肌组织能量代谢系统。通过HPLC，为测定心肌组织中ATP，ADP，AMP含量提供了一种快速、高效的定性定量分析方法，为生物样品中能量代谢相关含量的测定研究提供了参考。
[关键词]芪参益气滴丸； 肺心病； 能量代谢； HPLC； 含量测定
慢性肺源性心脏病(简称肺心病，PHD)，属于中医学 “肺胀”、“喘病”、“水肿”等范畴，病机多为肺、脾、心、肾亏虚，进而引起痰、瘀、水潴留。益气养阴、活血通络是其基本治法[12]。芪参益气滴丸(QS)具有益气通脉、活血止痛的作用，在临床上主要用于冠心病和心力衰竭，且对肺心病也有一定的疗效，但对肺心病的治疗机制尚不明确[3]。肺心病后期可出现全心衰，心肌能量代谢底物利用变化，能量消耗增加，游离脂肪酸堆积，抑制糖酵解，使心肌能量代谢进一步恶化[45]。有研究表明，QS能通过增加心肌组织中ATP的含量来改善心肌能量代谢[6]。作者推测QS可能通过改善心肌能量代谢的途径从而对肺心病起到治疗作用，本实验对此进行了研究。
, 百拇医药
1材料
岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；电子分析天平(BT125D，赛多利斯科学仪器有限公司)；超声破碎仪[Biosafer250up，赛飞(中国)有限公司]；超速离心机(sigma3k15，北京五洲东方科技发展有限公司)；超声清洗仪(KQ500E，昆山市超声仪器有限公司)。
QS浸膏(黄芪、丹参、三七、降香，天士力制药集团股份有限公司)；野百合碱(MCT，GR132140225，南京广润生物制品有限公司)；色谱纯乙腈(500 mL，天津市康科德科技有限公司)；三磷酸腺苷二钠，二磷酸腺苷二钠，5′腺嘌呤核苷酸二钠盐(批号20151104，北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化钠，磷酸二氢钾，氢氧化钾(500 g，分析纯，天津市化学试剂供销公司)；高氯酸(天津市化学试剂供销公司)。
40只雄性Wistar大鼠，180～200 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)20120001。
, 百拇医药
2方法
21实验动物饲养
饲养于天津市放射医学研究所，温度(22±2) ℃，湿度(60±5)%。饲料为标准鼠粮，自由摄食饮水。
22实验动物分组
将40只大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组：对照组(C，n=10)，模型组(M，n=10)，QS低剂量组(L，n=10)，QS高剂量组(H，n=10)。
23肺心病模型的复制
无水乙醇和生理盐水(2∶8)混合液将MCT配成1%的溶液备用。大鼠适应性喂养1周后，M，L，H组单次腹腔注射MCT(60 mg·kg-1)，C组腹腔注射相应体积的生理盐水。
24给药方法
, 百拇医药
造模次日起，L组灌服2倍临床等效剂量的QS浸膏(945 mg·kg-1)，H组灌服4倍临床等效剂量的QS浸膏(189 mg·kg-1)，C和M组灌服相应体积生理盐水，每日1次，连续给药6周后进行药效学研究。
25大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP的测定
251对照品的制备
称取ATP对照品111 mg，ADP对照品096 mg，AMP对照品119 mg，分别加蒸馏水定容至1 mL，各取3种储备液一定量混合后得混标溶液，4 ℃避光保存，备用。
252样品的制备
取大鼠右心肌组织约200 mg，按心肌组织质量高氯酸溶液(042 mol·L-1)体积 1∶5加高氯酸溶液，在溶液中剪碎心肌组织，于4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入KOH溶液(05 mol·L-1)调节pH在60左右，静置5 min，同条件下离心10 min，取上清液，过022 μm微孔滤膜，得到样品溶液[78]。
, 百拇医药
253色谱条件
Venusil MP C18色谱柱(46 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)磷酸盐缓冲液(B，pH 61)，梯度洗脱，0～20 min，0% A，20～30 min，0%～60%A，30～45 min，60%～0%A；柱温为室温；流速1 mL·min-1；检测波长254 nm；进样量20 μL。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。
26统计分析
实验数据均以±s表示，应用SPSS 170统计软件进行分析，ANOVA做不同组之间差异比较，P<005时为显著差异。
3结果
31高效液相色谱法方法学考察[9]
311专属性
, 百拇医药
ATP，ADP，AMP对照品进样后保留时间分别为74，92，178 min。
312线性关系考察
分别将储备液稀释2，4，8，16，32，76，900倍，制成系列对照品溶液。测定峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，结果见表1。
313检测限与定量限
将对照品储备液用蒸馏水逐级稀释，进样测定，4讨论
本实验通过改变不同的色谱条件，以及样品处理过程中的变量因素，筛选并建立了一种快速测定大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP含量的高效液相色谱方法，并且在此色谱条件下对ATP，ADP，AMP的检测进行了全面的方法学考察。, 百拇医药(耿诗涵 单秋月 许梦习 张译丹 宋丽丽 侯宁 张闻 张密霞 庄朋伟 张艳军)
[关键词]芪参益气滴丸； 肺心病； 能量代谢； HPLC； 含量测定
慢性肺源性心脏病(简称肺心病，PHD)，属于中医学 “肺胀”、“喘病”、“水肿”等范畴，病机多为肺、脾、心、肾亏虚，进而引起痰、瘀、水潴留。益气养阴、活血通络是其基本治法[12]。芪参益气滴丸(QS)具有益气通脉、活血止痛的作用，在临床上主要用于冠心病和心力衰竭，且对肺心病也有一定的疗效，但对肺心病的治疗机制尚不明确[3]。肺心病后期可出现全心衰，心肌能量代谢底物利用变化，能量消耗增加，游离脂肪酸堆积，抑制糖酵解，使心肌能量代谢进一步恶化[45]。有研究表明，QS能通过增加心肌组织中ATP的含量来改善心肌能量代谢[6]。作者推测QS可能通过改善心肌能量代谢的途径从而对肺心病起到治疗作用，本实验对此进行了研究。
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1材料
岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；电子分析天平(BT125D，赛多利斯科学仪器有限公司)；超声破碎仪[Biosafer250up，赛飞(中国)有限公司]；超速离心机(sigma3k15，北京五洲东方科技发展有限公司)；超声清洗仪(KQ500E，昆山市超声仪器有限公司)。
QS浸膏(黄芪、丹参、三七、降香，天士力制药集团股份有限公司)；野百合碱(MCT，GR132140225，南京广润生物制品有限公司)；色谱纯乙腈(500 mL，天津市康科德科技有限公司)；三磷酸腺苷二钠，二磷酸腺苷二钠，5′腺嘌呤核苷酸二钠盐(批号20151104，北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化钠，磷酸二氢钾，氢氧化钾(500 g，分析纯，天津市化学试剂供销公司)；高氯酸(天津市化学试剂供销公司)。
40只雄性Wistar大鼠，180～200 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)20120001。
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2方法
21实验动物饲养
饲养于天津市放射医学研究所，温度(22±2) ℃，湿度(60±5)%。饲料为标准鼠粮，自由摄食饮水。
22实验动物分组
将40只大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组：对照组(C，n=10)，模型组(M，n=10)，QS低剂量组(L，n=10)，QS高剂量组(H，n=10)。
23肺心病模型的复制
无水乙醇和生理盐水(2∶8)混合液将MCT配成1%的溶液备用。大鼠适应性喂养1周后，M，L，H组单次腹腔注射MCT(60 mg·kg-1)，C组腹腔注射相应体积的生理盐水。
24给药方法
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造模次日起，L组灌服2倍临床等效剂量的QS浸膏(945 mg·kg-1)，H组灌服4倍临床等效剂量的QS浸膏(189 mg·kg-1)，C和M组灌服相应体积生理盐水，每日1次，连续给药6周后进行药效学研究。
25大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP的测定
251对照品的制备
称取ATP对照品111 mg，ADP对照品096 mg，AMP对照品119 mg，分别加蒸馏水定容至1 mL，各取3种储备液一定量混合后得混标溶液，4 ℃避光保存，备用。
252样品的制备
取大鼠右心肌组织约200 mg，按心肌组织质量高氯酸溶液(042 mol·L-1)体积 1∶5加高氯酸溶液，在溶液中剪碎心肌组织，于4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入KOH溶液(05 mol·L-1)调节pH在60左右，静置5 min，同条件下离心10 min，取上清液，过022 μm微孔滤膜，得到样品溶液[78]。
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253色谱条件
Venusil MP C18色谱柱(46 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)磷酸盐缓冲液(B，pH 61)，梯度洗脱，0～20 min，0% A，20～30 min，0%～60%A，30～45 min，60%～0%A；柱温为室温；流速1 mL·min-1；检测波长254 nm；进样量20 μL。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。
26统计分析
实验数据均以±s表示，应用SPSS 170统计软件进行分析，ANOVA做不同组之间差异比较，P<005时为显著差异。
3结果
31高效液相色谱法方法学考察[9]
311专属性
, 百拇医药
ATP，ADP，AMP对照品进样后保留时间分别为74，92，178 min。
312线性关系考察
分别将储备液稀释2，4，8，16，32，76，900倍，制成系列对照品溶液。测定峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，结果见表1。
313检测限与定量限
将对照品储备液用蒸馏水逐级稀释，进样测定，4讨论
本实验通过改变不同的色谱条件，以及样品处理过程中的变量因素，筛选并建立了一种快速测定大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP含量的高效液相色谱方法，并且在此色谱条件下对ATP，ADP，AMP的检测进行了全面的方法学考察。, 百拇医药(耿诗涵 单秋月 许梦习 张译丹 宋丽丽 侯宁 张闻 张密霞 庄朋伟 张艳军)