普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用(2)
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参见附件。
1.4 血管瘤内皮细胞形态学观察、鉴定
1.4.1 形态学观察：倒置相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞生长情况和形态学特征，并用数码照相机记录观察的结果(图1)。
1.4.2 免疫荧光法鉴定：将血管瘤内皮细胞进行细胞爬片， PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS冲洗，0.3%的过氧化氢室温下封闭10 min，然后用正常血清室温下封闭10 min，分别加入第Ⅷ 因子相关抗原鼠抗人抗体(工作浓度l∶200) 4℃过夜，PBS冲洗后在暗室条件下加入鼠抗兔二抗荧光显色液，荧光显微镜下观察拍照(图2)。
1.5 MTT对血管瘤内皮细胞毒性的测定
1.5.1 MTT检测细胞抑制率：①将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化后配制成浓度为1～10×104个/ml的细胞悬液，经过细胞技术按10000细胞/孔接种于96孔板，每孔加200μl；②将平板置37℃、5%CO2湿度培养箱中24h后，于24h、48h、72h分别加入各个细胞样品对应的含有一定浓度药物(0μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml)的培养基，每个样本浓度设平行的三个孔，对照组加不含样本的培养液200μl，再放入培养箱中孵育；③于倒置显微镜下拍照，拍摄200×的细胞状态；④每孔加入用按5mg/ml新鲜配制的MTT溶液50μl，温育4h，使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO(二甲基亚砜)200μl，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值(OD)(检测波长570nm)，以溶剂对照处理细胞为对照组，按公式计算普萘洛尔对细胞的抑制率。
1.5.2 改良寇式法计算IC50：
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量，I:lg(最大剂量/相临剂量)，P:阳性反应率之和，Pm:最大阳性反应率，Pn:最小阳性反应率
1.6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡：①接种细胞至六孔板，吸除培养液，用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml胰酶消化细胞，待细胞变圆，部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化；②用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮.离心1 500转5min，弃上清；③加入3ml PBS，用漩涡震荡仪是细胞充分悬浮于PBS中，离心1 500转5min，弃上清；④加入300μl的裂解缓冲液(Binding Buffer)悬浮细胞；⑤Annexin V-FITC，Propidium Iodide (PI)使用前瞬时离心集液；⑥加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；⑦室温、避光、反应5～15min.8.在1 hour内，进行流式细胞仪的检测.用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。
1.7 统计结果χ2检验：不同浓度(0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml,120μg/ml)作用后血管内皮细胞作用不同时间(24h,48h,72h)后抑制率。统计学处理：应用spss17.0统计软件包对细胞增殖抑制率进行分析。采用总体方差分法,P<0.05,差异显著,有统计学意义,可以认为随普萘洛尔浓度的增大及作用时间的延长，普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用明显增强。
2 结果
2.1 组织块结合酶消化法培养初学管理血管内皮细胞并对细胞进行纯化(如图1)，扩增及采用免疫荧光法检测(如图2)。
2.2 MTT法检测培养于含有不同浓度(0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml)普萘洛尔培养基中作用不同时间(24h、48h、72h)后血管瘤内皮细胞的存活率。经实验数据分析，血管瘤内皮细胞伴随普奈落浓度的增大及作用时间的延长，血管内皮细胞的抑制作用明显增强(如图3)。
2.3改良寇氏法测定普萘洛尔作用血管瘤血管内皮细胞后的IC50为100μg/ml。
2.4流式细胞仪检测不同浓度普萘洛尔作用血管瘤内皮细胞后的细胞凋亡情况，结果显示普萘洛尔可明显促进血管瘤内皮细胞的凋亡(如图4a、b、c)。
3 讨论
3.1 普萘洛尔抑制血管瘤内皮细胞增殖的作用及其意义：2008年在Bordeaux儿童病院Léauté-Labrèze等医生用普萘洛尔治疗一位伴有严重的鼻部血管瘤的阻塞性、肥厚性心肌病的患儿时发现，患者面部的血管瘤逐渐减小，停用后仍然减小，最后血管瘤几近完全消失[1]。随后众多医生开始尝试在临床使用普萘洛尔治疗血管瘤，试图将其作为一种新的治疗血管瘤的药物。根据文献报道单独使用普萘洛尔治疗血管瘤得到一定的疗效，并未发现明显的并发症[2-3]，但是，没有说明其对血管瘤的明确作用机制，同时也没有一个统一给药剂量标准，处于临床尝试阶段。血管内皮细胞现已被公认为血管瘤增殖期占主要细胞成分。本实验取手术切除的血管瘤组织采用组织块法培养血管瘤内皮细胞并对其进行鉴定[4]，并将不同浓度普萘洛尔添加于血管瘤内皮细胞培养基中进行培养，探讨普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的增值影响，并试图筛选出普萘洛尔作用于血管瘤内皮细胞的最适浓度，为该药的临床应用提供了实验依据。
3.2 血管瘤是婴幼儿期常见的肿瘤，40%～60%发生于头颈部。近年来，许多作者对血管瘤的病变过程进行了相关研究，同时对实施了具体治疗的病例和只进行了保守观察的病例之间预后的差别行了比较，并制定了一定的治疗方案。体积较小、病变处于稳定期、消退期和消退完成期的血管瘤适于随访观察，增生期血管瘤需按照循序渐进的原则进行积极治疗。手术治疗不再作为早期血管瘤的首选，而是用于血管瘤后期残存病变的切除或修整。有些作者主张使KTP、Nd：YAG激光治疗等方法，更多主张使用闪光灯脉冲染料激光，但是组织内激光照射治疗会产生瘢痕，并且会对深部解剖结构产生损害，所以使用前应考虑到其安全性.综合先前各种治疗方法[5-9]，都有其明显的缺点，目前临床对表浅的血管瘤主张局部药物注射治疗，创伤小，不会产生明显的瘢痕，本实验旨在探索普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用并通过将血管内皮细胞培养于含有不同浓度普萘洛尔的培养基中，通过对其作用不同时间段进行检测，统计分析表明其对血管瘤内皮细胞有明显抑制作用，并通过改良寇氏公式计算出普萘洛尔作用血管内皮细胞的IC50为100μg/ml，这为临床用药治疗血管瘤提供了更准确的治疗依据，为该药的临床应用提供了实验依据。也为临床采用普萘洛尔治疗血管瘤提供了更准确的依据，同时增加了药物治疗血管瘤的选择。本实验采用流式细胞仪检测到普萘洛尔可以促进血管瘤内皮细胞的凋亡。这表明普萘洛尔可通过凋亡途径抑制血管瘤内皮细胞的增殖，可能为普萘洛尔治疗血管瘤的机制之一。
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