人canstatin cDNA分泌型真核表达载体的表达及生物学作用研究(2)
2结果
2.1转染的阳性克隆
药物筛选10 d，维持培养12 d后倒置显微镜下可见细胞聚集成团状生长，克隆生成。(见图1，10×40倍倒置显微镜下摄像)
图1aCHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞阳性克隆
图1bCHO-K1/pSecTag2B细胞阳性克隆
2.2RT-PCR结果
转染pSecTag2B/canstatin的细胞在700 bp左右扩增出目的条带，与人canstatin cDNA片段理论长度(684 bp)基本一致。而转染空载体和正常CHO-K1细胞未见目的条带(图2)。
图2RT-PCR结果
2.3western-blotting法检测上清液中目的蛋白
CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞培养上清液中的表达产物在26 KD 左右有阳性条带显示(图3) ，此蛋白的分子量比实际人Canstatin蛋白分子量(24KD)稍大，这是因为表达的融合蛋白在其N端连接着c-myc表位肽和6-组氨酸尾。而对照组CHO-K1和CHO-K1/pSecTag2B的表达产物，则未见明显的条带。
图3转染细胞表达产物的western-blotting分析
A,B,C: CHO-K1,CHO-K1/pSecTag2B,CHO-K1/ pSecTag2B/canstatin
2.4鸡胚绒毛尿囊膜实验结果
鸡胚绒毛尿囊膜(CAM )实验结果显示：对照组血管呈叶状生长，加样后血管密度无降低；而canstatin 蛋白实验组加样后能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成：给药区及其周围血管明显减少，血管纹理欠清晰，小血管分支少，通过鸡胚处理前后血管生成记数，实验组与对照组之间经统计学处理差异有统计学意义 (P, 百拇医药(胡 丽 朱建思 王成昆)
2.1转染的阳性克隆
药物筛选10 d，维持培养12 d后倒置显微镜下可见细胞聚集成团状生长，克隆生成。(见图1，10×40倍倒置显微镜下摄像)
图1aCHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞阳性克隆
图1bCHO-K1/pSecTag2B细胞阳性克隆
2.2RT-PCR结果
转染pSecTag2B/canstatin的细胞在700 bp左右扩增出目的条带，与人canstatin cDNA片段理论长度(684 bp)基本一致。而转染空载体和正常CHO-K1细胞未见目的条带(图2)。
图2RT-PCR结果
2.3western-blotting法检测上清液中目的蛋白
CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞培养上清液中的表达产物在26 KD 左右有阳性条带显示(图3) ，此蛋白的分子量比实际人Canstatin蛋白分子量(24KD)稍大，这是因为表达的融合蛋白在其N端连接着c-myc表位肽和6-组氨酸尾。而对照组CHO-K1和CHO-K1/pSecTag2B的表达产物，则未见明显的条带。
图3转染细胞表达产物的western-blotting分析
A,B,C: CHO-K1,CHO-K1/pSecTag2B,CHO-K1/ pSecTag2B/canstatin
2.4鸡胚绒毛尿囊膜实验结果
鸡胚绒毛尿囊膜(CAM )实验结果显示：对照组血管呈叶状生长，加样后血管密度无降低；而canstatin 蛋白实验组加样后能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成：给药区及其周围血管明显减少，血管纹理欠清晰，小血管分支少，通过鸡胚处理前后血管生成记数，实验组与对照组之间经统计学处理差异有统计学意义 (P, 百拇医药(胡 丽 朱建思 王成昆)