通脉丸中竹节香附素A及总皂苷含量测定(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
2.1.3 供试品溶液的制备 按通脉丸1/4处方量称取各味药材共计155.375 g，置圆底烧瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加热回流3次，每次80 min，合并提取液，备用。
2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除两头尖外其余药材，按2.1.2供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。
2.1.5 阴性干扰试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，供试品与对照品在相同保留时间处有色谱峰，阴性对照在此保留时间处无干扰峰(图1～3)。
2.1.6 线性关系考察 取对照品溶液3、5、10、15、20 μl，按上述的色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=71 649X+13 696(R2=0.999 6)，表明竹节香附素A在0.573～3.820 μg呈良好线性关系。
2.1.7 精密度试验 精密吸取竹节香附素A供试品溶液，重复进样6次，竹节香附素A峰面积的RSD为0.72%(n=6), 表明仪器精密度良好。
2.1.8 稳定性试验 精密吸取通脉丸醇提供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱图，测得竹节香附素A含量RSD为1.26%，表明供试品溶液稳定性良好。
2.1.9 重复性试验 平行吸取6份同一批供试品溶液，按上述色谱条件连续测定6次，结果RSD为0.76%(n=6)，表明此方法的重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品9份，每份10 ml，分别精密加入不同体积竹节香附素A对照品溶液，混匀。按上述色谱条件测定竹节香附素A含量，计算回收率，结果见表1。
2.1.11 验证试验 按处方比例平行取三份样品按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算竹节香附素A含量，分别为0.074 8、0.073 9、0.072 0 mg/ml。
2.2 总皂苷含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取竹节香附素A对照品2.42 mg于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.242 mg/ml的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 按通脉丸1/4处方量称取各味药材共计155.375 g，置圆底烧瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加热回流3次，每次80 min，合并提取液，放冰箱中备用。精密量取醇提液(室温)20 ml于蒸发皿中，水浴蒸干，用10 ml水溶解残渣，置分液漏斗中用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液置蒸发皿中蒸干，甲醇溶解残渣并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再精密量取甲醇定容液1 ml于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 测定波长的选择 精密量取0.5 ml竹节香附素A对照品溶液与1 ml供试品溶液置具塞试管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸(临用新配)0.5 ml，60%硫酸溶液3 ml，摇匀，60℃水浴显色20 min后取出立即冰水浴5 min，摇匀。立即在紫外-可见分光光度计于440～660 nm波长范围下扫描，同时以空白溶液作参比。对照品及供试品均在531 nm有特征吸收，故选531 nm为检测波长。吸收光谱见图4、5。
2.2.4 线性关系考察 精密量取竹节香附素A对照品溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 ml，置具塞试管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸(临用新配)0.5 ml，60%硫酸溶液3 ml，摇匀，60℃水浴显色20 min后取出立即冰水浴5 min，摇匀。以同法平行处理的空白溶液为空白对照，在531 nm处测定吸光度。以对照品质量(mg)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=4.336 8X-0.000 8，(R2=0.999 0)，在0.024 2～0.217 8 mg范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 精密量取供试品溶液0.5 ml于具塞试管中，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.36%(n=6)，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密量取供试品溶液0.5 ml于具塞试管中，依“2.2.4”项下方法显色，并分别在显色后0、5、10、15、20 min在531 nm处测定吸光度，结果RSD为0.43%，可见本测定方法在显色20 min内，吸光度值比较稳定，因此，测定最好在20 min内完成。
2.2.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.56%(n=6)，表明此方法的重复性良好。
2.3 加样回收率试验
精密量取已知总皂苷含量供试品9份，每份0.5 ml，分别加入不同体积的竹节香附素A对照品溶液，混匀，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸收度，计算回收率，结果如表2。
3 讨论
色谱方法及梯度条件选择：本法依据2010年版《中国药典》[2]中竹节香附素A含量测定方法，但药典中方法并不理想，更适合药材中竹节香附素A的含量测定；复方中成分复杂，干扰程度大，药典方法需改进。笔者考察了甲醇-水[4]、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等不同流动相及不同梯度条件，结果表明使用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱分离效果最好，出峰时间适宜。
通脉丸醇提液中主要含有竹节香附素A、黄芪甲苷、甘草酸类等皂苷类成分，单一测定某一成分具有片面性，不能有效代表处方中发挥药理效应的化学成分，因此采用比色法测定复方中总皂苷，从整体上把握处方中有效成分。文献[5-7]供选择的显色剂有香草醛-高氯酸、浓硫酸-甲醇、茴香醛-高氯酸和香草醛-浓硫酸等测定总皂苷，经试验比较得出，采用5%香草醛-60%硫酸比色法测定通脉丸方中总皂苷含量，其方法精密度、重现性、稳定性、加样回收率均较好。其他显色剂显色后，供试品与对照品特征吸收不一致、吸光度在很短的时间内变化较大、空白对照溶液颜色深等因素，造成含量测定稳定性差，精密度低。
本文建立了通脉丸中HPLC法测竹节香附素A及比色法测总皂苷的含量测定方法 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2204kb)。