血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用分析(1)
【摘要】 目的：探究血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用。方法：选取SPF级3月龄大鼠120只，体质量(300±50)g，制作腰椎不稳定模型并切除卵巢会加速椎间盘的退变，分为4组：A组为假手术组(control);B组为切除卵巢的模型组(model);C组为切除卵巢并注射雌激素组(estrogen);D组为切除卵巢并注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3-MA)。使用HE染色和免疫组织化学染色检测大鼠椎间盘退变程度及自噬程度，使用Westen Bolt检测大鼠血管内皮生长因子VEGF-A、p-mTOR、自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达量、凋亡信号通路相关蛋白Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：相比control组，model组和3-MA组大鼠椎间盘退变显著加重，自噬程度显著降低，VEGF-A、p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达顯著升高，Beclin-1和LC3蛋白表达显著降低，且差异有统计学意义(P<0.01);相比model组，estrogen组大鼠鼠椎间盘退变显著减轻，自噬程度显著升高，VEGF-A、p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著降低，Beclin-1和LC3蛋白表达显著升高，且差异有统计学意义(P<0.01)。结论：大鼠椎间盘退变后会促进血管生成因子表达增加，使得自噬水平显著降低，其机制可能是退变过程中出现的新生血管化激活了mTOR信号通路并促进细胞凋亡通路，抑制了椎间盘髓核细胞自噬过程。
【关键词】 椎间盘退变; 血管内皮生长因子; 自噬; 凋亡
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.15.072 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2019)15-0-04
随着我国人口老龄化和生活、工作方式的转变，退变性腰椎疾病的发生率近年来不断增高[1]。退变性腰椎疾病不仅会使得患者腰椎侧凸畸形，同时也会严重影响患者的生活质量。Zhang等[2]研究表明，脊柱退行性疾病的发病机制中，椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)发挥重要的始动和核心作用。自噬(autophagy)是在正常生理条件下或存在应激反应，如生长因子耗竭、氧化应激、营养剥夺[3]。一定程度的自噬可以在细胞受到外界影响时起到保护作用，但过度自噬也可能导致细胞死亡，这种死亡被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。血管内皮生长细胞因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成的中心调控者，这种细胞因子在生理及病理性血管生成中发挥着重要的作用[4]。哺乳动物雷帕霉素耙蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路可能对细胞自噬有一定的抑制作用[5]。张军等[6]研究表明，退变椎间盘组织中VEGF表达增加，会促使mTOR信号通路被激活，抑制了细胞自噬水平，促使椎间盘细胞向凋亡方向进展，从而加速了椎间盘退变的发生。本文旨在研究血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用，以期了解血管内皮生长因子对自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用和机理，从而为椎间盘退变的治疗提供一定的理论依据。
1 材料
1.1 实验动物
SPF级3月龄雌性大鼠120只，体质量(300±50)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，普通级，分12个笼子饲养，每个笼子10只。饲养于笔者所在医院动物中心实验室。
1.2 药物与试剂
胎牛血清购自美国Gibco公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司;caspase-3、caspase-9抗体购于上海安研有限公司;LC3、Beclin-1抗体购自武汉华联科有限公司;VEGF-A、mTOR抗体购自默克有限公司;苯甲酸雌二醇注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020529，规格1 ml：1 mg;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自sigma公司。
1.3 仪器
全自动组织脱水机购自德国SLEE公司;低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司;光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司;电子天平购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司;流式细胞仪购自Thermo Fisher公司。
2 方法
2.1 建立模型
建立腰椎不稳定模型，切开大鼠胸部显露胸椎下段、腰椎和骶骨上段，使用消毒后的手术刀切除全部腰椎棘突、棘上韧带、棘间韧带金腰段和两侧腰椎关节突关节的后外1/2，缝合深筋膜和皮肤，不缝合竖脊肌，另外A组大鼠仅切开皮肤后即缝合，作为假手术对照。根据刘光源等[7]研究表明，雌性大鼠切除卵巢后会加速椎间盘的退变。使用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为40 mg/kg，后固定大鼠，在无菌条件下经腹侧入路切除双侧卵巢。
2.2 3-MA储存液的配制
利用1×无菌PBS溶解3-MA粉末，配制成15 mmol/L的储存液，避光并在-20 ℃保存。
2.3 分组及药物干预
将大鼠随机分为4组：A组为假手术组;B组行双侧卵巢切除手术组;C组为行双侧卵巢切除手术并注射雌激素组，术后每只小鼠肌肉注射0.5 ml的雌激素;D组双侧卵巢切除手术，术后肌内注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)2 μl/只。
2.4 检测项目
2.4.1 HE染色观察 使用石蜡切片后脱蜡至水，用苏木素染色液染色5 min，用水冲洗3次后使用95%乙醇分色5～10 s，使用伊红染色液染色1 min继续使用乙醇脱水后用二甲苯透明5 min后用中性树胶封片;在400倍光学显微镜下观察。, 百拇医药(郭井泉 王俊峰)
【关键词】 椎间盘退变; 血管内皮生长因子; 自噬; 凋亡
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.15.072 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2019)15-0-04
随着我国人口老龄化和生活、工作方式的转变，退变性腰椎疾病的发生率近年来不断增高[1]。退变性腰椎疾病不仅会使得患者腰椎侧凸畸形，同时也会严重影响患者的生活质量。Zhang等[2]研究表明，脊柱退行性疾病的发病机制中，椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)发挥重要的始动和核心作用。自噬(autophagy)是在正常生理条件下或存在应激反应，如生长因子耗竭、氧化应激、营养剥夺[3]。一定程度的自噬可以在细胞受到外界影响时起到保护作用，但过度自噬也可能导致细胞死亡，这种死亡被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。血管内皮生长细胞因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成的中心调控者，这种细胞因子在生理及病理性血管生成中发挥着重要的作用[4]。哺乳动物雷帕霉素耙蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路可能对细胞自噬有一定的抑制作用[5]。张军等[6]研究表明，退变椎间盘组织中VEGF表达增加，会促使mTOR信号通路被激活，抑制了细胞自噬水平，促使椎间盘细胞向凋亡方向进展，从而加速了椎间盘退变的发生。本文旨在研究血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用，以期了解血管内皮生长因子对自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用和机理，从而为椎间盘退变的治疗提供一定的理论依据。
1 材料
1.1 实验动物
SPF级3月龄雌性大鼠120只，体质量(300±50)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，普通级，分12个笼子饲养，每个笼子10只。饲养于笔者所在医院动物中心实验室。
1.2 药物与试剂
胎牛血清购自美国Gibco公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司;caspase-3、caspase-9抗体购于上海安研有限公司;LC3、Beclin-1抗体购自武汉华联科有限公司;VEGF-A、mTOR抗体购自默克有限公司;苯甲酸雌二醇注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020529，规格1 ml：1 mg;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自sigma公司。
1.3 仪器
全自动组织脱水机购自德国SLEE公司;低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司;光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司;电子天平购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司;流式细胞仪购自Thermo Fisher公司。
2 方法
2.1 建立模型
建立腰椎不稳定模型，切开大鼠胸部显露胸椎下段、腰椎和骶骨上段，使用消毒后的手术刀切除全部腰椎棘突、棘上韧带、棘间韧带金腰段和两侧腰椎关节突关节的后外1/2，缝合深筋膜和皮肤，不缝合竖脊肌，另外A组大鼠仅切开皮肤后即缝合，作为假手术对照。根据刘光源等[7]研究表明，雌性大鼠切除卵巢后会加速椎间盘的退变。使用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为40 mg/kg，后固定大鼠，在无菌条件下经腹侧入路切除双侧卵巢。
2.2 3-MA储存液的配制
利用1×无菌PBS溶解3-MA粉末，配制成15 mmol/L的储存液，避光并在-20 ℃保存。
2.3 分组及药物干预
将大鼠随机分为4组：A组为假手术组;B组行双侧卵巢切除手术组;C组为行双侧卵巢切除手术并注射雌激素组，术后每只小鼠肌肉注射0.5 ml的雌激素;D组双侧卵巢切除手术，术后肌内注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)2 μl/只。
2.4 检测项目
2.4.1 HE染色观察 使用石蜡切片后脱蜡至水，用苏木素染色液染色5 min，用水冲洗3次后使用95%乙醇分色5～10 s，使用伊红染色液染色1 min继续使用乙醇脱水后用二甲苯透明5 min后用中性树胶封片;在400倍光学显微镜下观察。, 百拇医药(郭井泉 王俊峰)