消栓通脉颗粒逆转Th1/Th2亚群失衡治疗大鼠深静脉血栓(2)
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1 材料与方法
1.1 主要材料
Wistar大鼠80只，12周龄，体重200～250g，♂，SPF级，购自山东大学实验动物中心(许可证号：SCXK鲁20090001)。大鼠自由饮水和摄食，饲养室温度23～25℃，相对湿度7%左右，定期紫外线室内消毒，适应性饲养3d后开始实验。消栓通脉颗粒(山东中医药大学附属医院药剂科制备，鲁药制字 Z0120030051)。药物组成：茵陈、桃仁、赤芍等。制备：用蒸馏水制成悬浊液，每1mL含0.6g消栓通脉颗粒。生理盐水(山东华鲁制药有限公司生产，H37022750)。大鼠抗小鼠荧光抗体：FITC-CD4、PE-IL-IFNγ、PE-IL-4均购自美国BD Pharmigen公司。
1.2 DVT大鼠模型建立
根据Reyers法建立大鼠深静脉血栓形成模型40只，随机分为实验组与模型组，各20只。造模术后动物自由饮水，普通全价颗粒饲料，不用抗生素，按照人与动物公斤体重比值进行药物剂量的折算。实验组灌胃消栓通脉颗粒组，剂量为0.6g/(100g·d)，连续灌胃8～15d。模型组：连续灌胃生理盐水8~15d。假手术组：20只大鼠，麻醉后，分离下腔静脉，不予结扎，直接缝合腹膜、皮肤，术后给予生理盐水连续灌胃8~15d。20只正常大鼠作为正常对照组，给予生理盐水连续灌胃8～15d。
1.3 标本收集与Th1、Th2亚群检测
参照文献报道[3]，无菌分离大鼠脾脏，针栓研磨制成单细胞悬液，200目铜网过滤，调整细胞浓度为1×106个/mL，加入佛波酯30μg/L、离子霉素(Ionomycin)1mg/L、莫能霉素(Monensin)1.7μg/L，37℃，5% CO2孵育4h。收集细胞，1×PBS洗2遍，去上清，加入小鼠血清，室温避光孵育30min。将外标抗体FITC-CD4按说明书加入到细胞悬液中，4℃避光孵育30min；1×PBS洗2遍，去上清；BD固定穿膜试剂盒固定穿膜(按说明书操作) ......
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